Persiapan standar:
Siapkan standar stok campuran dengan menimbang secara akurat (± 0,01 mg) sekitar 10 mg dari setiap standar referensi kavalakton ke dalam labu ukur 10 mL. Tambahkan 7,0 mL metanol dan sonicate sampai larut. Encerkan dengan volume dengan metanol dan campuran.
Perhatikan: Atau, siapkan standar stok kavain dengan cara yang sama dan gunakan faktor respons kavalakton untuk dikuantifikasi.
Encerkan standar stok untuk membuat minimum kurva standar empat poin. Pengenceran standar yang disarankan untuk stok adalah 1:10, 1:25, dan 1: 100 menggunakan metanol.
Perhatikan: Simpan standar pada suhu dingin (0 - 5 ° C). Kavalactones menurun dengan cepat setelah 48 jam. Persiapan standar referensi segar sebelum setiap analisis direkomendasikan.
Aparat
· Neraca analitik terkalibrasi akurat hingga ± 0,01 mg
· Labu, volumetrik, Kelas A, berbagai macam ukuran
· Botol, kromatografi dengan tutup
· Sistem Kromatografi Cair Kinerja Tinggi seperti yang dijelaskan dalam bab USP. Verifikasi dan dokumentasikan bahwa peralatan, perangkat lunak, dan subsistem memenuhi persyaratan kinerja untuk Kualifikasi Instalasi / Kualifikasi Operasi (IQ / OQ).
· Filter, 0,45 µm, Gelman Acrodisc nilon (P / N 4426), Whatman Puradisc ™ Polypropylene (Kat. No. 6788-2504), Whatman GD / X Glass (Kat. No. 6894-2504) atau Sonicator setara
· Kolom, YMCbasic, 5 µm, 4,6 x 250 mm ( No. Cat. BA99S05-2546WT). Kolom Setara, YMC J'Sphere H80, 4μ, 4,6 x 250 (Kat. No. JH08S04-2546WT).
Reagen
· Air, kadar HPLC atau Nanopure
· Metanol, kadar HPLC
· Asetonitril, kadar HPLC
· Asam Fosfat, ACS kelas Reagen
Persiapan sampel:
Bahan tanaman
Timbang dengan akurat (± 0,1mg) sekitar 750 mg batang yang ditumbuk halus, dikupas, atau bahan akar.
Tempatkan bahan ke dalam labu ukur 50 mL bersama dengan 40 mL metanol / air (70/30). Sonicate selama 60 menit pada suhu kamar.
Biarkan labu mendingin hingga suhu kamar dan encerkan hingga volume dengan metanol / air (70/30) dan aduk.
Saring dan tempatkan sampel ke dalam botol dan tutup HPLC.
Ekstrak Bubuk dan Lunak (Tempel)
Timbang dengan akurat (± 0,1 mg) ekstrak 100 mg ke dalam labu ukur 50 mL. (Berat 100 mg didasarkan pada kandungan kavalakton 50-60% dalam ekstrak.) Catatan: Ekstrak dihomogenisasi dengan hati-hati sebelum pengambilan sampel. Ini dilakukan dengan menempatkan ekstrak dalam wadah yang direndam dalam bak air panas 60 ° - 80 ° C hingga mengalir bebas.
Tambahkan 40 mL metanol dan sonicate selama 10 menit atau sampai semua padatan larut.
Biarkan labu mendingin hingga suhu kamar dan encerkan hingga volume dengan metanol dan campuran.
Saring dan tempatkan sampel ke dalam botol dan tutup HPLC.
Sampel serbuk
Ekstrak kava sering dicampur atau disemprotkan kering ke berbagai pembawa. Untuk berhasil menguji sampel bubuk, perlu untuk mengembangkan langkah persiapan sampel yang memulihkan kavalactones dari pembawa. Ini dapat dilakukan dengan terlebih dahulu mengekstraksi dengan metanol atau air murni.
Ketentuan Kromatografi:
Kolom: YMCbasic, 5 µm, 4,6 x 250 mm
Suhu Kolom: 40 ° C
Laju aliran: 0,6 mL / menit untuk YMCbasic; 1,0 mL / menit untuk J'Shere
Fase Seluler: asam fosfat isokratik 0,1%: isopropil alkohol: asetonitril (64:16:20 v / v)
Deteksi: 220 nm (246 nm sebagai alternatif untuk meningkatkan selektivitas)
Volume Injeksi: 5 μL
Jalankan Waktu: 30 menit
Prosedur:
Siapkan solusi standar referensi dan persiapan sampel sesuai petunjuk.
Buat injeksi tunggal pelarut ekstraksi kosong.
Buat suntikan tunggal dari persiapan standar.
Buat plot linearitas area puncak standar versus konsentrasi standar.
Lakukan suntikan tunggal pada preparasi sampel.
Hitung konsentrasi kavalakton dalam sampel.
Kesesuaian sistem:
Koefisien korelasi regresi linier harus ≥0,999. Resolusi antara puncak desmethoxyyangonin dan yangonin harus ≥1.8.
Shaanxi Y-Herb Bioteknologi Co, Ltd